細胞培養一般過程

　　一、準備工作

　　準備工作對開展細胞培養異常重要，工作量也較大，應給予足夠的重視，準備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養箱及其他儀器的檢查與調試，具體內容可參閱有關文獻。

　　二、取材

　　在無菌環境下從機體取出某種組織細胞(視實驗目的而定)，經過一定的處理(如消化分散細胞、分離等)后接入培養器皿中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的培養稱為原代培養。理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養，實際上幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個體的組織容易培養，分化程度低的組織比分化高的容易培養，腫瘤組織比正常組織容易培養。取材后應立即處理，盡快培養，因故不能馬上培養時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養液中保存。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。由組織并分離分散細胞的方法可參閱有關文獻。

　　三、培養

　　將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如系組織塊培養，則直接將組織塊接入培養器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養基。如系細胞培養，一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數，按要求以一定的量(以每毫升細胞數表示)接入培養器皿并直接加入培養基。細胞進入培養器皿后，立即放入培養箱中，使細胞盡早進入生長狀態。正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的內容包括細胞是否生長良好，形態是否正常，有無污染，培養基的PH是否太酸或太堿(由酚紅指示劑指示)，此外對培養溫度和CO2濃度也要定時檢查。一般原代培養進入培養后有一段潛伏期(數小時到數十天不等)，在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養，將一瓶中的細胞消化懸浮后分兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為"一代"。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質，也可能僅有不死性(Immortality)而無惡性。培養正在生長中的細胞是進行各種生物醫學實驗的良好材料。

　　四、凍存及復蘇

　　為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度--196℃，將細胞收集凍存管中加入含保護劑(一般為二甲亞砜或甘油)的培養基，以一定的冷卻速度凍存，終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養器皿中進行培養。凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。

　　細胞培養注意事項

　　1、實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%乙醇擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70%ethanol擦拭無菌操作臺面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后，再進行下一個細胞株的操作。

　　2、無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。

　　3、小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

　　4、工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無菌操作臺(少ClassⅡ)。操作過程中，應避免引起aerosol之產生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。

　　5、定期檢測下列項目:5.1CO2鋼瓶之CO2壓力5.2CO2培養箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。5.3.無菌操作臺內之airflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預濾網(300小時/預濾網，3000小時/HEPA)。6.水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750)，定期更換水槽的水

　　6、粉末培養基配制好后(加了血清)，一般在4度盡量不要超過1個月，如在-20度存放時間可長一些，但好也不要超過3-4個月，可能對于永生化細胞株來說要求不是太高，細胞嬌弱，放置時間不宜過長。

　　7、開紫外線照射臺的時候，就將培養基、酶、DHANKS液那到室外讓它自然升溫。這樣40分鐘后，溫度也升上來了。有很多人將其放到37度水浴鍋里加熱。一定要注意水浴鍋的衛生，有的常年不清洗，里面很臟，容易在外面瓶身上吸附大量細菌。因此用時也一定要勤換水。從水浴鍋拿出后，好找個毛巾擦干上面的水。