常用抗體熒光染料的選擇

隨著免疫熒光技術的不斷發展，熒光染料及其標記的抗體偶聯物也被廣泛的應用于生物學實驗中。

目前，市場上抗體及蛋白標記的熒光染料主要有CFTM系列(BIOTIUM, USA); Alexa Fluor? 系列(Life technology, USA); DyLight系列; Cy系列; IR Dye系列等等。使用多的為Alexa Fluor?系列和CFTM系列。

一、CFTM系列染料的核心對比Alexa Fluor?系列具有以下幾點優勢：

1、新型羅丹明核心

羅丹明染料以優異的耐光性和良好的熒光量子產量著稱。因此很多 Alexa Fluor? 染料具有羅丹明核心結構，但是，傳統羅丹明的化學結構很難從長波長的熒光染料延伸遠紅外區域甚是更具挑戰性的近紅外區域，而且生物偶聯后其水溶性并不理想。 Biotium 科學家發現從綠色到近紅外多色熒光的羅丹明染料的新型化學方法。該方法被有效的應用于CF染料的產品中，尤其是遠紅外CF染料，而且通過這種方法制備的染料不僅水溶性而且耐光性*。

2、特異性高的近紅外染料

近紅外染料大的特點是比可見光范圍要大很多，大滴的染料常會導致染料水溶性低、染料聚合體多、熒光量子產量差等問題。為了解決這些問題，許多商用的近紅外染料比如 AlexaFluor? 、 DyLight?dyes 和IRDyes? 近紅外染料，在制備時吸附了大量的帶負電荷的磺化基團，其磺化作用可以在一定程度上會提高染料的溶解性和熒光性，但這樣也帶來了另一些更加嚴重的問題，經這種染料標記的生物耦聯物的非特異性結合。Biotium 的科學家用革命性的方法設計出近紅外染料CF，在避免引入大量負電荷的情況下，極大的保證了染料優異的理化特性。Biotium 近紅外的CF 染料以花青或羅丹明染料為核心結構，該核心結構的特殊化學修飾限制了染料的分子內位移，從而獲得染料的高量子產率和更好的水溶性。因此，近紅外CF染料比其他近紅外染料熒光強度更高，光穩定性好。重要的是，在免疫印跡實驗上應用近紅外CF染料標記蛋白質樣品相對于其他商業用近紅外染料制備的抗體偶聯物，大限度的提高了信噪比。

3、優異的標記效率

生物偶聯后的活性染料一般很容易水解，會在運輸，操作及儲存中帶來諸多不便，終致染料結合效率低下。像Alexa Fluor?dyes ，DyLight?dyes and IRDyes? 等嚴重的磺化作用有較強的吸濕性，惡化水解作用等問題。所有Biotium的CF染料具有相對穩定的胺活性的SE基團型，這比大部分AlexaFluor 染料的SE更耐水解?？傮w來說，CF染料SE產品一貫的給出更高的標記效率，提供給用戶更好的使用價值。

二、選擇方案：

1、藍色（350-450nm處激發）

CF 350、Alexa Fluor 350、AMCA等——亮藍和紫外光激發；

CF350是類似于 Alexa Fluor 350 和傳統熒光染料AMCA的藍色熒光染料，CF350的熒光強度高于 Alexa Fluor350、AMCA ,吸附在蛋白上的熒光超過50%, 水溶性更好, 耐光性非常亮, 更容易與現有的綠色熒光基團區分；

CF 405S/ CF 405 M、Alexa Fluor 405 ----近乎的匹配藍色二極管激光器；

CF 405S/ CF 405 M 、Alexa Fluor 405與近來使用的熒光顯微鏡和流式細胞儀405nm;譜線的藍色二極管激光器的匹配。在流式細胞儀上的分析結果顯示CF 405S/ CF 405 M熒光信號強度高于Alexa Fluor 405染料1.7倍。

2、綠色（488nm處激發）

CF 488A、Alexa Fluor 488、FITC、FAM、DyLight 488、Cy2等----針對488nm 氬離子激光器的綠色熒光染料；

以上染料其標記的抗體蛋白適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細胞儀；流式細胞儀的FL1通道檢測；或者可用于熒光顯微鏡技術；

CF 488A低限度的帶電量降低了與抗體耦聯物的非特異性結合；在紅色通道溢出少于Alexa Fluor 488；耐光性好；水溶性好和pH 不敏感；良好的穩定性和活性染料的標記率。

Alexa Fluor 488在較寬的PH值范圍內保持穩定（PH4~10）；

FITC激發波長488nm，大發射波長525nm；缺點熒光強度易受PH值影響，PH值降低時其熒光強度減弱。

3、橙紅色（543-555nm處激發）

CF 543、Alexa Fluor 546、ATTO550、Cy 3、DyLight 549、Rhodamine (TRITC) 匹配543nm的橙色熒光染料；

CF ?543 熒光條帶明亮，耐光，水溶性好，確保了CF 543染料與抗體的耦聯物保持優異的水溶性，為該波段亮的橙色熒光染料。例如：同等的標記程度下，CF 543標記的羊抗鼠IgG抗體的亮度高于用Alexa Fluor 546 標記的2~10倍。

CF 555、Alexa Fluor 555、Tetramethylrhodamine (TAMRA) 等匹配Cy3濾光片的橙色熒光染料；

4、紅色（568-594nm處激發）

CF 568、Alexa Fluor? 568、ATTO 565、Rhodamine Red等568nm處紅色熒光染料；

CF 568染料耐光性好；水溶性；比Alexa Fluor 568 標記的抗體亮度更亮；

CF 594、Alexa Fluor? 594、ATTO? 594、DyLight? 594、Texas Red 等亮紅色熒光染料；

CF594由于其高量子產量和優異的水溶性而比AlexaFluor594 明亮2~4倍。同時CF594 對光極其穩定，使它能被理想地應用于諸如共聚焦顯微鏡和單分子顯像條件苛刻的應用中去。

5、遠紅外（620-660nm處激發）

CF 620R、LightCycler Red 640等620nm處；

CF 620R是以紅色熒光染料羅若丹（rhodamine）為基礎的遠紅外的熒光染料，該染料有高熒光亮度和極度的耐光性。它的吸收和發射光譜為617 和639nm，該染料能被用于熒光能量共振轉移中高能量的接收者，或者在激發和發射窗口能和該染料的光譜特性匹配的條件下，被應用于多色檢測中的高熒光量采集。染料的的水溶性有利于生物耦合在水介質中，更好的保持耦聯物的生物特異性結合。

CF 633、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Cy 5、DyLight 633、DyLight 649等633/635nm 激光線的佳染料熒光染料；

CF 633染料的優點：當被633nm 氦氖激光或635nm 紅色二極管激光激發時，產生亮的抗體耦聯物；光穩定性遠高于AlexaFluor 647；的水溶性；

CF 640、Alexa Fluor 647、ATTO 647N、Cy 5、DyLight 649等遠紅外熒光染料；

CF 640R 的優點：以紅色染料羅丹明（rhodamine）為基礎，吸收和發射峰類似Cy5、Alexa Fluor647；但以羅丹明（rhodamine）為基礎的紅色染料CF 640R它大的優點就是對光穩定性，Cy5 和 Alexa Fluor 647以花青素為基礎，因此有著和花青素一樣的特點即耐光性較差。*的亮度和耐光性使CF 640R 被理想的用于共聚焦顯微鏡和單分子成像等條件苛刻的檢測中。

CF 647、Alexa Fluor 647、ATTO 647N、DyLight649等遠紅外熒光染料；

以花青素為基礎的遠紅外熒光染料CF 647 比Cy 5、Alexa Fluor 647 明亮。

CF 660、Alexa Fluor? 660、Allophycocyanin (APC)等介于遠紅外近紅外之間的熒光染料；

6、近紅外（680-790nm處激發）

CF 680R/680、Alexa Fluor 680、Cy 5.5、IR Dye 680等近紅外熒光染料；

CF 680 是高水溶性的以花青素為基礎的染料，分子量大約為3000。該染料標記抗體，發出亮的熒光和在免疫染色光譜相似的染料中產生高的信噪比。

CF 680R 分子量約為900，更適合標記核酸或者相對小的生物分子。

CF 680R 是新型的以羅丹明（rhodamine）為基礎的高熒光亮度, 極度耐光性染料，這使它可被理想地用于共聚焦顯微鏡，單分子成像等條件要求苛刻的應用中。

CF 750、CF 770 和 CF 790等近紅外熒光染料；

CF 750、CF 770、CF 790是領域內真正具有突破性的長波長的新型染料代表。其他近紅外染由于受到染料聚集和穩定性差等因素的影響而導致熒光亮度有限?；贐iotium科學家研制的新型分子工程技術，近紅外CF 染料克服了這些問題。即使在633 nm 被激發，CF750 也會比APC-AlexaFluor 750擁有足夠的亮度來在流式細胞儀檢測中帶來更好的信噪比，而且不存在串聯染料的低穩定性等問題。另外，近紅外CF 染料高度水溶性，沒有會增加抗體耦聯物非特異性結合的過剩的負電荷，也代表了該產品的性能。